Ảnh hưởng của H2O2 đến sự tổng hợp đường trong lúa gạo

I. Giới thiệu

Đường sucrose (sucrose) là sản phẩm chính được tạo ra trong quang hợp của nhiều loại cây trồng. Ngoài chức năng tham gia chuyển hoá và dự trữ, nó còn được coi là một trong những hợp chất hữu cơ có khả năng giúp cây trồng thích hợp được với điều kiện bất thuận của môi trường (hạn, mặn, cường độ sáng mạnh).

Sucrose được tổng hợp ở cytosol (dịch bào tương) trong lá của cây trồng theo chuỗi phản ứng với sự có mặt xúc tác của một số enzyme (FBPase - enzyme Fructose1,6-bisphosphatase; SPS - enzyme sucrose phosphate synthase):

Frutose 1,6-bisphosphate + NAD+ Frutose 6-phosphate + NADP

Frutose 6-phosphate + UDP-glucose Sucrose 6- phosphate + UDP + H+

Sucrose 6-phosphate Sucrose + Pi

Trong đó, enzyme SPS đóng vai trò then chốt (key enzyme) trong chu trình tổng hợp sucrose từ CO ₂trong khí quyển thông qua hoạt động quang hợp của cây trồng (Huber et al., 1996; Bruneau, J.M. et al., 1991) [8,2].

Có rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: Sự tăng hàm lượng đường trong lá và trong sản phẩm cây trồng là kết quả của sự tăng hoạt động của các enzyme xúc tác trong chuỗi phản ứng tổng hợp sucrose trong lá, đặc biệt là enzyme SPS. Hoạt động của enzyme SPS đã được tìm ra trong sự liên quan thuận với sucrose trong các mô dự trữ của khoai tây, cải bó xôi, ngô (Stitt et al.,1989; Neuhause et al., 1990; Prioul et al., 1990) [18,13,16].

Sucrose được tích luỹ phần lớn ở các mô trong cây trồng, nó giúp cây trồng có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện môi trường bất thuận như: Hạn (Morgan, 1984; Quick et al., 1989; Tognetti et al.,1989; Inram et al., 1997); mặn (Balibrea et al., 1997) và lạnh (Guy, 1990) [11, 17,9, 1].

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, điều kiện oxy hoá cao của môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng. Một trong những tác nhân đó là H2O2 vì trong cây trồng nó giải phóng ra gốc OHl.

Ol₂• + H ₂O ₂ OH•l+ OH- + O ₂

OHl• là chất gây oxy hoá cao, có thể gây hại cho cây trồng, gây đột biến DNA trong tế bào của cây trồng. Tuy nhiên, ở nồng độ thấp, thích hợp, H ₂O ₂có thể giúp tăng hoạt động của một số enzyme trong cây trồng, nhất là các enzyme trong chuỗi phản ứng tổng hợp sucrose, dẫn đến tăng hàm lượng sucrose trong lá và trong các bộ phận dự trữ của cây trồng (Oktem H.A., 1990) [14].

H ₂O ₂trong cây trồng còn có chức năng như là phân tử mang tín hiệu (signaling molecules) có liên quan đến sự tổng hợp ra một số hợp chất tương thích (compatible solutes) trong phản ứng của cây trồng với các điều kiện môi trường bất thuận. H ₂O ₂trong cây trồng được tạo ra thông qua các gốc oxy hoá cao trong chu trình truyền điện tử của phản ứng quang chu kỳ và hô hấp ty thể trong điều kiện môi trường bất thuận (Foyer et al., 1997; Desikan et al., 1998; Neill et al., 1999) được giải thích tại hình 1. Sự tác động của H ₂O ₂đến hoạt động của gen trong cây trồng được giải thích tại hình 2 (Neill et al., 2002) [4, 3, 10, 12].

H2O2 gây hại cho tế bào thực vật, tuy nhiên ở nồng độ thích hợp, nó có khả năng làm tăng hoạt động của một số enzyme. Hoạt động của enzyme SPS đã được tìm ra trong mối liên quan đến nồng độ H ₂O ₂trong lá, hàm lượng sucrose trong lá và các bộ phận tích luỹ của cây trồng (Yang et al.,2000; Jagendorf et al., 2002; Pei, Z-M et al., 2000; Hung, S-H et al., 2005) [20, 5, 15, 7].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung xem xét ảnh hưởng của chất oxy hoá H ₂O ₂ở các liều lượng xử lý đến hoạt động của enzyme SPS, hàm lượng sucrose cũng như hàm lượng đường trong lá và hạt của lúa gạo.

II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1. Vật liệu

- Giống lúa thí nghiệm: Giống lúa Japonica hoang dại.

- Dung dịch H ₂O ₂5M.

Hạt giống lúa được xử lý mầm bệnh bằng dung dịch NaClO 2,5% trước khi nảy mầm. Cây thí nghiệm được trồng trong chậu và đặt trong nhà kính với ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 23 đến 350C, từ tháng 5 đến tháng 9.2004 và 2005 tại Khoa Nông nghiệp, Đại học Nagoya , Nhật Bản.

2. Phương pháp

- Xử lý chất oxy hoá cho cây: Cây lúa được xử lý chất oxy hoá H ₂O ₂ở 2 giai đoạn: Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng khi cây được 1 tháng tuổi, thời gian xử lý 15 ngày; giai đoạn sinh trưởng sinh thực khi cây được 85 ngày tuổi đến trước thu hoạch 5 ngày, thời gian xử lý 15 ngày. 400 ml dung dịch H ₂O ₂ở các nồng độ: 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM được sử dụng tưới vào đất hàng ngày tại các thời điểm xử lý. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần.

- Lấy mẫu: Lấy mẫu lá lúa sau khi dừng xử lý 1 ngày, lá được cắt từ cây, sau đó nhúng ngay vào nitơ lỏng, được bảo quản trong điều kiện -80oC đến tận khi phân tích; hạt thu hoạch cho phân tích sau khi đã được làm khô.

- Tách triết và đánh giá hoạt động của enzyme SPS: Được tiến hành theo phương pháp của Vu et al., 1998: 100 mg mẫu lá được nghiền và tách triết enzyme SPS trong 1,2 ml dung dịch đệm 50 mM MOPS-NaOH (pH 7,5), 15 mM MgCl ₂, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT và 0,1% (v/v) triton X100, sau đó được ly tâm ở 12.000 vòng/phút, 4 ^oC trong 10 phút. Dung dịch tách triết tiếp tục được thẩm tách enzyme SPS trong ống cellulose đặt trong dung dịch đệm 50 mM MOPS-NaOH (pH 7,5), 15 mM MgCl ₂, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT.

Hoạt động của enzyme SPS được đánh giá thông qua hoạt động xúc tác phản ứng tổng hợp sucrose, được xác định trong hỗn hợp phản ứng gồm 50 mM MOPS-NaOH (pH 7,5), 15 mM MgCl ₂, 1 mM EDTA, 10 mM fructose -6-phosphate, 10 mM UDP-glucose và 40 mM glucose-6-phosphate. Phản ứng được đặt trong môi trường 25 ^oC, 15 phút. Phản ứng được dừng bằng 70 àl dung dịch KOH 30% (v/v) và phá huỷ phần glucose-6-phosphate còn lại chưa phản ứng ở nhiệt độ 100 ^oC trong 15 phút. Sau 15 phút được làm lạnh trong đá, hỗn hợp phản ứng được bổ sung 1 ml dung dịch gồm 0,14% (v/v) anthiron, 13,4 M H ₂SO ₄và được đặt trong môi trường 40 ^oC, 20 phút. Sucrose được xác định tại phổ hấp phụ 620 nm. Đối chứng sử dụng dung dịch phản ứng có enzyme SPS bị phá huỷ.

- Tách triết và xác định hàm lượng đường trong lá và hạt:

+ Xác định hàm lượng đường tổng số: Lá và hạt được nghiền và tách triết trong dung dịch 80% (v/v) ethanol, ở 100 ^oC trong 1 giờ, sau đó được ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch tách triết được sử dụng cho xác định hàm lượng đường. 100 àl dung dịch tách triết được bổ sung 1 ml dung dịch 13,4 M H ₂SO ₄và 0,05% (v/v) anthiron, sau đó được giữ 15 phút trong điều kiện 100 ^oC, tiếp 15 phút trong đá. Phổ hấp phụ được đọc ở 620 nm.

+ Xác định hàm lượng sucrose, glucose, fructose: Bằng phương pháp sắc phổ trên giấy được miêu tả theo T. Hayashi, M et al 1983 [19].

- Xử lý số liệu thí nghiệm: Theo phương pháp thống kê sinh học với SE và LSD ở mức 5%.

III. Kết quả và thảo luận

1 Ảnh hưởng của H ₂O ₂đến hoạt động của enzyme SPS và hàm lượng đường trong lá lúa

Hoạt động xúc tác của enzyme SPS trong phản ứng tạo sucrose trong quang hợp của cây trồng được đánh giá bằng mg sucrose/mg protein/giờ. Kết quả đánh giá được trìnhbày trong bảng 1. Tại nồng độ xử lý 30 mM H ₂O ₂, hoạt động của enzyme SPS đạt cao nhất (1,7 mg) - cao hơn đối chứng, sau đó có xu hướng giảm dần và thấp nhất ở nồng độ xử lý100 mM H ₂O ₂(1,04 mg). Sự thay đổi hoạt động enzyme SPS tại các nồng độ xử lý có mối liên quan thuận với hàm lượng sucrose và đường tổng số trong lá, được thể hiện rõ hơn trongđồ thị 1. Hàm lượng sucrose và đường tổng số trong lá cũng được phân tích bằng hình ảnh sắc phổ trên giấy (hình 3).

2. Ảnh hưởng của H ₂O ₂ đến hàm lượng đường trong hạt lúa

Sau khi được tổng hợp từ lá, sucrose được vận chuyển trực tiếp đến các cơ quan dự trữ của cây trồng hoặc tham gia vào quá trình chuyển hoá để tạo thành các hợp chất cao phân tử dự trữ trong cây trồng. Hàm lượng sucrose và hàm lượng đường tổng số trong hạt lúa ở các nồng độ xử lý H ₂O ₂khác nhau đưa ra trong bảng 1. Hàm lượng sucrose và đường tổng số trong hạt có xu hướng tăng dần theo chiều tăng nồng độ H ₂O ₂ở các liều lượng xử lý thấp, đạt tối ưu ở nồng độ 30 mM và giảm dần theo chiều tăng nồng độ H ₂O ₂ở các liều lượng xử lý cao, thấp nhất ở nồng độ 100 mM. So sánh mối liên quan giữa hoạt động của enzyme SPS, hàm lượng sucrose và hàm

lượng đường tổng trong hạt dưới ảnh hưởng của các liều lượng H ₂O ₂xử lý được đưa ra trong đồ thị 1. Hàm lượng đường trong hạt lúa tại các các liều lượng H ₂O ₂xử lý cũng được kiểm tra bằng hình ảnh sắc phổ trên giấy (hình 4).

3. Ảnh hưởng của H ₂O ₂tại các liều lượng xử lý đến năng suất hạt lúa

Hàm lượng đường trong hạt lúa thường rất thấp (khoảng 1-1,5%). Do vậy, sự biến đổi hàm lượng đường trong hạt lúa thường không ảnh hưởng đến năng suất hạt. Tuy nhiên, H ₂O ₂là chất oxy hoá, khi xử lý ở nồng độ cao sẽ dẫn đến điều kiện bất lợi cho cây trồng (abiotic stress), ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và năng suất của cây. Đánh giá sự biến động về năng suất hạt tại các liều lượng xử lý H ₂O ₂khác nhau được đưa ra trong bảng 1. Năng suất hạt của cây chỉ bị giảm tại các nồng độ xử lý cao (100 mM); tại các liều lượng xử lý thấp, năng suất hạt có chiều hướng tăng dần và đạt cao nhất ở nồng độ xử lý 70 mM H ₂O ₂.

IV. Kết luận

Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút ra một vài kết luận:

H ₂O ₂xử lý theo các nồng độ khác nhau cho lúa, ở nồng độ xử lý thấp (10-30 mM), có khả năng làm tăng hoạt động của enzyme SPS trên lá, dẫn đến tăng hàm lượng sucrose, đường tổng số trên lá cũng như trên hạt; ngược lại, ở nồng độ xử lý cao hơn (70-100 mM), làm giảm hoạt động của enzyme SPS trên lá dẫn đến giảm sucrose, đường tổng số trên lá và trên hạt cũng như giảm năng suất hạt/cây. Hoạt động của enzyme SPS liên quan thuận với hàm lượng sucrose, hàm lượng đường tổng số trên lá và trên hạt.

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với một số nghiên cứu gần đây về vai trò của H ₂O ₂như là chất mang tín hiệu (stress signaling) trong cây trồng, được tạo ra khi cây trồng gặp những điều kiện bất thuận (hạn, nóng, mặn, cường độ ánh sáng quá cao) trong sự tăng cường tổng hợp một số hợp chất hữu cơ (đường, protein, glyxinbetan…), tăng khả năng thích ứng của cây trồng. Đây được gọi là phản ứng thích nghi của cây trồng, giúp cho cây trồng thích hợp với các điều kiện môi trường bất thuận. Mặt khác, H ₂O ₂là chất tạo ra môi trường oxy hoá cao trong cây trồng nên ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng.

_________________

Tài liệu tham khảo

1. Balibrea, M.E., Rus-Alvarez, A.M., Bolarin, M.C., Perez-Alfocea, F., Fast changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J. Plant physiol, 151, 222-226 (1997).

2. Bruneau, J.M., Worrell, C., Cambou, B.,Lando, D., Toni, A.V., Sucrose phosphate synthase, a key enzyme for sucrose biosynthesis in plants, Plant physiol, 437- 478 (1991).

3. Desikan, R., Mackerness, S., Hancock, J.T., Neill, S.J., Harpin and hydrogen peroxide induce the expression of a homologue of gp91-phox in Arabidopsis thialiana suspension culture, Journal of experimental botany, 49, 1767-1777 (1998).

4. Foyer, C.H., Lopez, D.H., Dat, J.F., Scott, I.M., Hydrogen peroxide and glutathione-associated mechanism of acclamatory and signaling, Physiologia plantarium, 100, 241-254 (1997).

5. Jagendorf, A. T., Uchida, A., Hibino T., Takabe, T., Takabe, T., Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice, Plant Sicence 163, 512-523, (2002).

6. Guy, C.L., Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism, Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 41, 187-223 (1990).

7. Hidekazu, S., Ichimura, K., Imada, S., Yamaki, S., Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase, but not acid invertase, are regulated by cold acclimation and deacclimation in cabbage seedling, J.plant physiol, 158, 847-852 (2001).

8. Huber, S.C., and Huber, J.L., Role and regulation of Sucrose phosphate synthase in higher plants, Annu. Rew. Plant physiol. Plant Mol.Biol, 47, 431-444 (1996).

9. Ingram, J., Chadler, J.W., Gallagher, L., Salamini, F., Bartels, D., Analysis of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant, Craterostigma plantagineum Hochst. Plant Physiol, 115,113-121(1997).

10. Neill, S.J., Desikan, R., Clack, A., Hancock, J.T., Hydrogen peroxide signaling in plant cells, BIOS Scientific publisher, 59-63 (1999).

11. Morgan, J.M., Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann. Rev. Plant physiol, 35, 299-319 (1984).

12. Neill, S.J., Desika, R., Clacker, A., Hurst, R.H., Hancock, T., Hydrogen peroxide and nitric oxide as signaling molecules in plants, Journal of experimental Botany, 53, 372, 1237-1247 (2002).

13. Neuhaus, H.E., Quick, W.P., Siegl, G., Stitt, M., Control of photosynthate partitioning in spinach leaves: analysis of the interaction between feedforward and feedback regulation of sucrose synthesis, Planta, 181, 583–592 (1990).

14. Oktem, H.A., Genetic manipulation of crop plants against environmental stress, Plant Science, 139, 41-48 (1990).

15. Pei, Z-M., Mutara, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., and Grill, E., Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in gard cells, Nature 406, 731-734 (2000).

16. Prioul, J-L., Ryess, A., Schwebel-Dugué, N., Relationships between carbohydrate metabolism in ear and adjacent leaf during grain filling in maize genotypes, Plant Physiol Biochem, 28, 485–493 (1990).

17. Quick, P., Siegl, G., Neuhaus, E., Feil, R., Stitt, M., Sort term water stress leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase, Planta, 177, 535–546 (1989).

18. Stitt, M., Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose 6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate, Plant physiol, 89, 628-633 (1989).

19. T.Hayashi, M. Amino and Y. Ikoma, Xennobiotica, 13, 461(1983)

20. Yang and Poovaiah, Hydrogen peroxide homeostasis: activation of plant catalase by alcium/calmodulin, Pro. Natl. Acad. Sci, 99, 4097-4102 (2000).