Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis

Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhóm β-lactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao. Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra.

Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phù hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Chủng giống vi sinh vật

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2 (Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học); các hóa chất dung để phân tích, định lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48.

Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912

Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh.

Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường saccharose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 là 280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6 - 8 % so với môi trường lên men.

Nghiên cứu động thái quá trình lên men chủng S. orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men. Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác.

Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912

Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gây chủng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8-30,3% đối với xử lý bào tử và 66,33% đối với xử lý tế bào trần.

Sau đó, các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) có hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml).

Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến

Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l.

Ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt độ và tỉ lệ giống đã xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 20-30% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin.

Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được nuôi trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phân môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml. Cũng tại thời điểm này chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng độ đạt cực đại là 2983 mcg/ml.

Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men

Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S. orientalis 4912-81-61 bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung môi Butanol - axit acetic - H2O (4 : 3 : 7) cho giá trị Rf của các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap trên máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử là 1449,27 và bằng sắc ký lỏng cao áp trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu là ở 4,4 phút giống như vancomycin chuẩn (Merck). Sắc ký đồ HPLC cho thấy không có các pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4%.

Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344%. Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck).